U procesu provođenja genetskih studija često se susrećemo s nedostatkom uzoraka RNA, primjerice za proučavanje sićušnih anatomskih oralnih tumora, čak i jednostaničnih uzoraka i uzoraka specifičnih genskih mutacija koje se u ljudskim stanicama prepisuju na vrlo niskim razinama.Naravno, za COVID-19 test, ako brisevi nisu na pravom mjestu ili nedovoljan broj puta tijekom uzorkovanja, veličina uzorka će biti vrlo mala, zbog čega je Komisija za zdravstvo i planiranje obitelji izašla prije dva dana i prošao test, a ako uzorkivač nukleinskih kiselina nije uzeo šest uzoraka, možete to prijaviti.
Osjetljivost reagensa je važna jer imamo ovaj ili onaj problem, pa što možemo učiniti da poboljšamo osjetljivost RT-PCR?
Prije nego što razgovaramo o mogućim rješenjima, spomenimo dvije velike komplikacije u vezi sa situacijom koju smo upravo spomenuli.
Prije svega, brinemo o gubitku RNA kada imamo samo nekoliko staničnih populacija u našem uzorku.Ako se koriste tradicionalne metode odvajanja i čišćenja, kao što je metoda kolone ili metoda precipitacije nukleinske kiseline, postoji velika mogućnost da će se nekoliko uzoraka izgubiti.Jedno rješenje je dodavanje molekule nosača, kao što je tRNA, ali čak ni tada nema jamstva da je naš eksperiment oporavka u redu.
Dakle, koji je bolji način?Dobra opcija za kultivirane stanice ili mikroanatomske uzorke je korištenje izravne lize.
Ideja je podijeliti stanice na 5 minuta, pustiti RNA u otopinu, zatim zaustaviti reakciju na 2 minute, zatim dodati lizat izravno u reakciju obrnute transkripcije tako da se ne izgubi RNA, i na kraju staviti rezultirajuću cDNA izravno u reakciju u stvarnom vremenu.
Ali što ako, zbog ograničene početne točke ili male količine ekspresije ciljnog gena, možemo reciklirati svu RNK, a opet ne osigurati dovoljno predložaka da dobijemo dobar signal u stvarnom vremenu?
U ovom slučaju, korak predpojačavanja može biti vrlo koristan.
Slijedi shema za povećanje osjetljivosti nakon obrnute transkripcije.Prije početka, moramo se raspitati nizvodno koje su mete zainteresirane, kako bismo dizajnirali specifične primere za te mete za predamplifikaciju.
To se može postići stvaranjem miješanog primera s do 100 pari primera i reakcijskim ciklusom od 10 do 14 puta.Stoga je potrebna glavna mješavina posebno dizajnirana za ovaj zahtjev za prethodno pojačanje dobivene cDNA.
Razlog za postavljanje broja ciklusa između 10 i 14 je taj što ovaj ograničeni broj ciklusa osigurava slučajnost između različitih ciljeva, što je ključno za istraživače koji trebaju kvantitativne molekularne informacije.
Nakon predamplifikacije možemo dobiti veliku količinu cDNA, tako da je osjetljivost detekcije na pozadini uvelike poboljšana, a možemo čak i razrijediti uzorak i izvesti više PCR reakcija u stvarnom vremenu kako bismo eliminirali moguće slučajne pogreške.
Vrijeme objave: 11. travnja 2023